mRNA疫苗在癌症治疗中的当前进展和未来展望
来源：生物制品圈 | 发布时间：2024-07-30
摘要：信使核糖核酸（mRNA）疫苗是一种相对较新的疫苗类别，已在多种传染病和癌症的免疫治疗中显示出巨大潜力。在过去两年中，针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗对抗SARS-CoV-2做出了巨大贡献，这促使了mRNA疫苗研究的热潮，尤其是在癌症疫苗研究方面。与传统的癌症疫苗相比，mRNA疫苗具有显著的优势，包括高效产生保护性免疫反应、相对较低的副作用和较低的获取成本。在这篇综述中，我们详细阐述了癌症疫苗和mRNA癌症疫苗的发展，以及mRNA癌症疫苗的潜在生物学机制和在各种肿瘤治疗中的最新进展，并讨论了该领域的挑战和未来方向。
信使核糖核酸（mRNA）疫苗是一种相对较新的疫苗类别，已在多种传染病和癌症的免疫治疗中显示出巨大潜力。在过去两年中，针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗对抗SARS-CoV-2做出了巨大贡献，这促使了mRNA疫苗研究的热潮，尤其是在癌症疫苗研究方面。与传统的癌症疫苗相比，mRNA疫苗具有显著的优势，包括高效产生保护性免疫反应、相对较低的副作用和较低的获取成本。在这篇综述中，我们详细阐述了癌症疫苗和mRNA癌症疫苗的发展，以及mRNA癌症疫苗的潜在生物学机制和在各种肿瘤治疗中的最新进展，并讨论了该领域的挑战和未来方向。
- 信使核糖核酸疫苗将肿瘤抗原传递给抗原呈递细胞（APCs），通过主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类向免疫细胞（CD8+ T细胞，CD4+ T细胞）呈递。
- 通过APC表达的模式识别受体，也可以诱导先天免疫活动。
- 可以将抗原受体（如嵌合抗原受体和T细胞受体）引入淋巴细胞。
- 在不同细胞类型中表达免疫调节蛋白，如其他单克隆抗体格式、趋化因子受体、共刺激配体和Toll样受体等。
1.引言
作为人类最畏惧的疾病之一，免疫疗法的出现彻底改变了多种癌症类型的治疗方式，并为癌症患者带来了希望。由于从基础研究成功转化为临床治疗，以及其简单而优雅的手段，癌症免疫疗法在2013年被确定为“年度突破”。20世纪，由于该领域缺乏已知机制，癌症免疫疗法的作用主要被低估，同时，开发适当的临床方案的途径充满了曲折和变化。威廉·B·科利，一位被普遍认为是免疫疗法先驱的美国外科医生，在19世纪末首次尝试操纵免疫系统来对抗无法手术的癌症患者。通过注射一种活菌和灭活菌（称为“科利毒素”）的混合物，如化脓性链球菌和嗜血杆菌，科利发现在癌症患者中诱导了强烈的免疫反应，导致肿瘤进展的缓解。这次试验被认为是历史上首次记录的抗癌免疫疗法干预。然而，由于当时对复杂的体液免疫系统知识不足以及传统治疗的显著进步，癌症免疫疗法的下一次革命性浪潮直到21世纪晚期才到来，直到达成共识，人们意识到增强先天防御以摆脱恶性细胞是癌症治疗的一个里程碑。近年来，由于该领域取得的显著进展迹象，癌症疫苗引起了极大的关注。癌症疫苗最初是在1988年开发的。米切尔等人用同种异体黑色素瘤裂解物免疫黑色素瘤患者，并成功地在数百名患者中诱导了抗黑色素瘤的免疫反应。随后，由于肿瘤抗原（TAs）的发现——在肿瘤组织中过度表达的抗原物质，调节肿瘤的启动、进展和转移，科学家们正在为使用潜在候选者进行癌症治疗提供更多机会。在过去的20年中，已经提出了几种抗原传递方法，其中一些在癌症患者中显示出强烈的抗肿瘤免疫反应和临床反应。
从技术上讲，肿瘤疫苗的发展与传染病疫苗的发展大致相似，包括全细胞疫苗、DNA疫苗和信使核糖核酸（mRNA）疫苗、抗原疫苗和树突状细胞（DC）疫苗。到目前为止，已经进行了数百项临床试验，并展示了治疗性疫苗所带来的希望和挑战。与传统的手术、化疗或放疗不同，治疗性癌症疫苗被认为可以特异性激活免疫系统并针对肿瘤细胞，从而带来更高的反应率和更好的生活质量。总的来说，癌症疫苗有助于阻断肿瘤生长、复发或转移，近期免疫肿瘤学研究的进展为疫苗策略的出现开辟了前所未有的途径。近年来，由于低毒性、快速生产和编码抗原的多样性等优势，mRNA疫苗作为重要的肿瘤疫苗类型，在肿瘤生物治疗领域迅速发展。具体来说，外源性SAMs编码肿瘤特异性抗原被引入到体细胞中，通过合成抗原诱导免疫反应，从而实现对肿瘤细胞的特异性杀伤。mRNA疫苗在肿瘤生物治疗中的希望和进展已在近期研究中得到了很好的确立。这篇综述总结了并详细讨论了mRNA疫苗的优势和局限性。
2.癌症疫苗：从基础开始
2.1.癌症疫苗的基础知识
免疫系统是一个由细胞和蛋白质组成的复杂网络。技术上，它为身体提供所谓的免疫力，这是通过个体免疫系统中存在抗体或细胞介导的免疫来实现的，以对抗疾病。在多种免疫反应机制中，疫苗对于增强身体的免疫系统至关重要，例如通过刺激产生针对外来病原体的抗体。在过去的几十年中，肿瘤抗原被广泛开发并被证明在癌症免疫疗法中具有重要意义，主要促进了癌症疫苗的发现，并引发持久有效的免疫反应。总的来说，癌症疫苗可以根据其应用和功能进行分类。经典的癌症预防疫苗针对可能导致某些癌症的病毒，而治疗性疫苗可以刺激对现有肿瘤的免疫反应。从理论上讲，15%的癌症病例可以通过抗击感染来阻断，事实证明感染被认为是估计中四分之一癌症的原因。从理论上讲，接种疫苗预防导致癌症的病毒比使用癌症治疗疫苗治疗癌症更容易、更便宜、更有效。然而，由于免疫原性差和安全性有限，只有两种预防性癌症疫苗成功通过了临床试验，并已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准。
2.2.针对致癌病毒的癌症预防疫苗
致癌病毒涉及大约12%的人类癌症。过去三四十年中，已有确凿证据表明，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染和高危人类乳头瘤病毒（HPVs）感染分别是肝癌和宫颈癌的重要原因。HBV疫苗被誉为首个“抗癌”疫苗，于1982年首次用于HBV，随着一种高度创新的新型预防性疫苗方法的开发，新生儿广泛接种HBV疫苗对5岁儿童慢性HBV感染的发病率产生了巨大影响。此外，HPV是一个普遍的公共卫生问题，宫颈癌的高发病率得到了德国病毒学家哈拉尔德·楚豪森的确认，他在20世纪80年代首次从宫颈癌肿瘤中分离出HPV菌株，这一理论促成了2006年HPV疫苗的首次人体试验，命名为Gardasil。自那以后，又有两种疫苗获得批准：2007年的Cervarix和2014年的Gardasil 9。截至2020年6月，全球已有100多个国家将HPV疫苗纳入其国家免疫计划，作为其常规疫苗接种计划的一部分。尽管如此，许多致癌DNA病毒仍在研究之中。
2.3.癌症治疗疫苗：癌症免疫治疗的新希望
与针对病毒的预防性疫苗不同，治疗性癌症疫苗旨在操纵免疫系统，对体内的癌细胞或组织发起攻击。技术上，治疗性癌症疫苗的发展前提取决于肿瘤相关抗原（TAA）或肿瘤特异性抗原（TSA）的存在。迄今为止，大多数癌症疫苗都针对TAAs，这些是癌细胞异常表达的自身蛋白，然而，在开发针对TAAs的疫苗之前必须克服障碍。例如，免疫细胞可能将TAAs识别为自身抗原，将其从免疫库中移除，导致免疫反应失败。TSAs代表特定于肿瘤细胞的抗原，由于它们与免疫细胞的特异性反应而引起了广泛关注。然而，由于新抗原对每个患者和肿瘤类型的独特性，为了降低TSA疫苗的成本和复杂性，需要进行进一步的优化。
尽管在有效性和安全性方面仍存在重大挑战，但多种治疗性疫苗策略正在临床前阶段开发或在临床试验中评估。根据疫苗开发中使用的平台，治疗性疫苗被分为几个主要类别。其中，mRNA疫苗是传统疫苗方法的有希望的替代品。到目前为止，多种mRNA癌症疫苗已在各种临床试验中使用，这表明这种策略可以广泛适用于癌症疫苗。
3.mRNA癌症疫苗：历史和最新进展
如前所述，癌症和传染病是人类目前面临的两个最常见挑战，尽管有多项正在进行的研究和治疗措施，但尚未取得令人满意的结果。像COVID-19、埃博拉、寨卡、HIV和麻疹这样的新流行病的出现，迫切需要寻找一种与以往不同的新方法或新技术来克服医疗危机，改善人类生活。19世纪几乎不可能实施的一项休眠技术在过去十年中再次尝试，并以核酸编码治疗的形式重新树立了信心。最近的研究进展使我们对人类遗传学有了更深入的了解，并为mRNA作为传染病和癌症治疗协议的有希望的治疗途径创造了途径。人类基因组包含近21306个编码蛋白质的基因。DNA中的基因在细胞核内转录成mRNA。转录的mRNA是一种高度不稳定的分子，它将来自核基因的信息传递到细胞质中的核糖体进行蛋白质合成。因此，mRNA是我们体内蛋白质合成过程的中间体。鉴于mRNA可以翻译成蛋白质，这一原理可以用来生产任何蛋白质，如缺陷酶、激素、抗体、细胞结构蛋白和外来抗原。因此，由于mRNA疫苗易于生产、操纵和传递到细胞中，它们引起了人们的关注。与其他基因组/基因工程技术相比，这些技术需要操纵基因组，可能会导致不希望的效应，如脱靶效应。使用mRNA疫苗可以最小化这些效应。值得注意的是，在癌症中，mRNA被用来诱导免疫系统破坏肿瘤相关抗原和生长因子。当前的COVID-19大流行迫切需要开发一种新疫苗，并以惊人的速度加速了mRNA治疗研究的发展。
尽管疫苗学在预防各种疾病方面取得了杰出成就，但癌症疫苗的发展仍存在重大障碍，这强调了开发更有效和功能齐全的疫苗平台的必要性。然而，由于mRNA的不稳定性、高度固有的免疫原性和体内传递效率，mRNA疫苗的研究曾经落后于基于DNA和蛋白质的疫苗开发，直到技术革新和研究投资认识到mRNA作为开发新创新疗法的多功能工具，特别是在过去几十年的疫苗学领域。
3.1.历史
自1961年首次发现mRNA以来，对mRNA结构和功能的研究就一直令人着迷。值得注意的是，人类在1969年首次实现了分离mRNA的体外翻译，这支持了研究人员在体外合成特定蛋白质。随着疫苗传递系统的快速发展，研究人员在1978年开发了脂质体包裹的mRNA传递系统，这使得在目标细胞内调节蛋白质成为可能。接着是Jirowski等人在1992年成功使用血管加压素mRNA治疗小鼠糖尿病。最重要的是，在1990年，Wolff等人首次使用编码蛋白质的mRNA对小鼠进行疫苗接种。Jirowski等人跟随Wolff，成功使用pressin mRNA治疗小鼠糖尿病。这些结果扩大了基于mRNA的治疗范围。1995年，在肿瘤免疫疗法中，研究人员通过首次引入编码荧光素酶和癌胚抗原的mRNA疫苗并取得良好结果，证实了mRNA应用的潜力。然而，这项技术近年来在临床上逐渐得到验证，mRNA结构稳定性和传递方法的技术难题取得了突破。进入2000年代，由于其独特的优势（设计和检测的便捷性和速度、固有的免疫原性、快速准备和忽略不计的插入突变风险），mRNA疫苗进入了快速发展时期。2005年取得了显著成就，发现修饰核苷酸RNA是非免疫原性的，为进一步的mRNA疫苗研究带来了新的希望。2015年，前列腺癌疫苗进入临床试验。2019年，研究人员发现了用于癌症免疫疗法的SAMs的可变剪接。重要的是，在2020年和2021年，随着两种针对COVID-19的mRNA疫苗Comirnaty（BNT162b2）和Spikevax（mRNA-1273）的批准，mRNA疫苗的医学价值得到了实现。如今，mRNA疫苗经常被报道，未来它们可能成为疾病预防和治疗的基本技术之一。
图1 时间线：mRNA疫苗研究的突破及其在癌症治疗中的进展。
3.2.mRNA癌症疫苗的优势
尽管mRNA疫苗在癌症治疗中的应用仍处于起步阶段，但体外转录mRNA的众多特性已表明其疫苗潜力，此外，与肽或DNA疫苗相比，mRNA疫苗表现出几个显著优势，可能对更广泛的癌症更有效。
首先，基于RNA的疫苗开发相对较快且成本较低，这得益于体外转录（IVT）反应的高产量和先进的工业设置，这些设置彻底改变了mRNA的制造，并在一定程度上显著降低了生产成本。例如，在2020年的1期临床试验中，病毒基因组序列公布后10周，第一位志愿者接受了COVID-19 mRNA疫苗。截至2020年11月，已有两款新型mRNA疫苗等待授权作为潜在的COVID-19疫苗，即Moderna的mRNA-1273和BioNTech/Pfizer合作的BNT162b2。mRNA疫苗的快速生产能力对于迅速控制各种传染病和多种癌症的传播具有极大价值。
其次，mRNA疫苗不是使用病原体颗粒或灭活病原体制造的，非感染属性大大降低了不希望的免疫反应的风险。此外，与DNA癌症疫苗相比，mRNA的给药是通过非整合平台进行的，只需要存在于细胞质中，而不需要像DNA疫苗那样进入细胞核。这一特性绕过了将外源基因整合到宿主基因组的风险，并可能消除了质粒DNA需要穿过的额外细胞（即核）膜，因此，没有感染或插入突变的潜在风险。此外，由于各种修饰和传递方法的进步，mRNA降解由生理细胞过程控制，体内mRNA半衰期可以设计成受调控，这再次大大保证了mRNA疫苗的安全性。
第三，早期临床试验结果表明，mRNA疫苗产生了可靠的免疫反应，并且对健康个体的耐受性良好，效率相对较高。一方面，借助IVT的帮助，简单的程序允许从短寡核苷酸到几千碱基的RNA分子的模板指导合成，mRNA可以在无细胞环境中生产，不仅避免了微生物污染或培养细胞生产中的质量和安全问题，而且还大大提高了制造效率，加速了下游纯化，并导致了快速且成本效益高的制造。另一方面，体内传递领域的当前成就已成功地将mRNA配方化为载体分子，例如纳米颗粒，允许在细胞质中快速摄取和表达。除了将常规mRNA复合成稳定的纳米颗粒外，使用自我复制RNA或复制体RNA（RepRNA）可能还会进一步改进RNA疫苗，这些RNA源自具有完整病毒RNA复制机制基因的阿尔法病毒基因组骨架，但编码病毒结构蛋白的基因被替换为编码疫苗抗原的转基因，从而大大诱导强烈的免疫反应。精准医疗，或基于每个人的独特基因构成的新型医疗方法，为确定个人独特的疾病易感性提供了基因组蓝图，并为疾病预防和治疗开辟了新篇章。由于在mRNA癌症疫苗开发中使用了TSAs或TAAs，基于mRNA的个性化癌症疫苗有潜力定制治疗，以确保最佳的响应和最高的安全边际，以确保更好的患者护理。
图2 mRNA疫苗引发的免疫反应。
与病毒感染类似，mRNA疫苗通过内吞作用进入细胞后，在细胞质中短暂表达并累积抗原，然后这些抗原被有效处理成肽段并装载到MHC-I分子上。另一方面，mRNA表达的蛋白也可以在分泌和循环后激活MHC-II途径，或者直接将细胞质中的抗原传递到溶酶体。因此，mRNA疫苗能够同时刺激细胞免疫和体液免疫反应，并发挥更好的保护作用。
从技术上讲，通过下一代测序，可以在患者的肿瘤细胞上识别新的表位，这有助于指导免疫系统区分癌细胞和正常细胞。随后，mRNA疫苗可以定制以适应每位患者肿瘤的特定抗原谱，一旦注射，它有潜力指导患者的细胞表达选定的新表位并进行清除。总之，这些优势展示了其固有的高效率特性，非常适合癌症治疗使用。
3.3.mRNA癌症疫苗的分类
mRNA癌症疫苗根据它们的形态、大小、物理和化学属性被广泛分类为不同的类别。其中一些已在全球范围内得到广泛应用，如基于脂质的纳米传递系统（图3A）、基于聚合物的纳米传递系统（图3B）、基于多肽的纳米传递系统（图3C）、基于混合的纳米传递系统（图3D）、基于病毒的纳米传递系统（图3E）以及其他（图3F）。根据不同的疫苗特性，一些知名的类别如图3所示。
图3 各种代表性的基于mRNA的疫苗传递系统。
(A) 基于脂质的传递系统。(B) 基于聚合物的传递系统。(C) 基于多肽的传递系统。(D) 基于混合的传递系统。(E) 基于病毒的传递系统。(F) 其他系统。
3.3.1. 根据治疗性或预防性属性
治疗性疫苗旨在诱导细胞介导的免疫来根除癌细胞，然而预防性疫苗的目标是产生抗体。治疗性癌症疫苗更关注自身免疫并发症，因为自身免疫并发症仍然是预防疗法中一个未解决的问题。尽管HPV和HBV疫苗已获得FDA批准，并在癌症预防方面取得了良好的成绩，但尚未报告预防性mRNA癌症疫苗的临床试验。治疗性和预防性疫苗彼此之间并不十分明显，有时预防性疫苗也可以作为治疗性疫苗使用，因为它们在降低临床复发风险方面经过测试是有效的。
3.3.2. 根据mRNA类型
基于RNA结构，主要有两种mRNA癌症疫苗：非复制型mRNA（nrRNA）疫苗、自我放大型mRNA（SAM）疫苗和转录放大型mRNA疫苗。nrRNA疫苗是成熟mRNA的合成类似物，其构建包含传统的mRNA疫苗序列，通常包括通用的5’帽子、5’非翻译区（UTRs）、一个开放阅读框（ORF）、3’UTRs和一个3’聚（A）尾部。简单的结构和相对较小的尺寸是主要优势，但相应地，这也限制了体内构建的nrRNA疫苗的活性和稳定性，这是主要缺点。为了增强抗原表达的持久性，可以添加佐剂来优化RNA分子的结构。TriMix是一种新型的高效安全佐剂策略，展示了卓越的T细胞刺激能力和增强树突状细胞成熟。TriMix由布鲁塞尔自由大学开发，由SAMs组成，编码三种免疫激活蛋白——CD70、CD40配体（CD40L）和组成性活跃的TLR4。在艾滋病患者中应用TriMix裸mRNA已取得预期结果，并引起了广泛关注。对于癌症治疗，De Keersmaecker B的临床研究表明，通过使用TriMix电穿孔与基于树突状细胞的mRNA疫苗一起使用，在晚期黑色素瘤患者中取得了显著的抗肿瘤反应。
SAM疫苗是通过基因工程正链RNA病毒生产的，包括阿尔法病毒、小RNA病毒、黄病毒等，其编码结构蛋白的基因被抗原序列替换。与nrRNA相比，SAM疫苗构建中有一个额外的复制组分，指导目标细胞传递后的细胞内mRNA扩增。因此，SAM疫苗具有更高水平的抗原表达和持久的效力，且剂量更低，这是它们的明显优势。
转录放大型mRNA疫苗是一种新类型，由Beissert等人设计。它具有可以“转录”放大RNA的复制酶，这意味着两个基因在不同的RNA上同时起作用。这种特殊结构允许RNA长度更短，这可以降低规模化生产和制造的难度，但相应地增加了两种RNA药物的传递和制造的复杂性。尽管转录放大型mRNA疫苗尚未在临床癌症治疗中报告，但这种方法有着有希望的未来，因为它可以通过实施利用其特殊结构的新策略进一步改进。
3.3.3.根据给药途径
尽管对动物模型或患者中不同给药途径的系统评估仍有待研究，但不同的给药途径影响mRNA癌症疫苗的效力和免疫刺激区域。目前，mRNA癌症疫苗的给药策略包括皮下注射、皮内注射、结节内注射、肌肉注射、静脉注射、肿瘤内注射、鞘内注射等（图4），这些是刺激免疫反应的主要但经济的方法。局部注射被认为是一种高度免疫能力强的方法，它增强了局部疫苗反应，并通过淋巴运输触发远端免疫反应。内淋巴结或近淋巴结（进入软组织）免疫通常由小鼠淋巴结的外科暴露指导。尽管内淋巴结注射操作复杂，但与其他给药途径（皮内/皮下/近淋巴结）相比，Kreiter等人观察到强烈的T细胞免疫。气管给药针对肺血管，通常用于肺部病变，以气溶胶形式给药mRNA。鞘内注射应用于脑病变，以帮助在难以到达的中枢神经系统细胞中呈现抗原。对于系统性给药，mRNA癌症疫苗通常作为纳米级药物制剂给药，并通过静脉内给药，主要针对肝脏，因为其丰富的窗孔毛细血管。
图4 mRNA疫苗的不同给药策略。
1. 肌肉注射：LPTX-COVID19-B (NCT04765436)，mRNA-1273 (NCT04860297)。2. 眼内注射：mRNA-5671 (NCT03948763)，ECI-006 (NCT03394937)。3. 静脉注射：CV9202 (NCT03164772)，BNT111 (NCT04526899)，TriMix (NCT01066390)。4. 肿瘤内注射：OX40L (NCT03739931, NCT03323398)，BNT-114，BNT-122 (NCT02316457)。5. 鞘内注射：NR2B。6. 皮下和皮内注射：皮下注射：mRNA-1608，mRNA-1468，mRNA-4359。皮内注射：CV9202 (NCT03164772)，TriMix(NCT01066390)，mRNA-1608，mRNA-1468，mRNA-4359。
3.4.mRNA疫苗技术的最新创新
mRNA的基本结构包括5’帽子、5’非翻译区（UTR）、编码区、3’UTR和聚（A）尾部。5’UTR或5’帽子对有效产生蛋白质至关重要，这些结构可能调节帽依赖性翻译启动。3’UTR由最佳聚（A）信号组成，需要mRNA的稳定性和增强蛋白质翻译。此外，密码子优化有助于促进蛋白质生产，mRNA的丰度和稳定性。总之，mRNA的稳定性和翻译决定了RNA疫苗生产的成功（图5A）。传统技术，如改良核苷类似物的结合、编码序列的优化、mRNA的内淋巴结传递、体外装载的树突状细胞、基因枪和电穿孔对mRNA疫苗生产是巨大的突破，然而这些方法复杂或昂贵或太难用于人类。因此，需要创新技术来有效生产mRNA疫苗。最近，mRNA疫苗技术有三个最重要的创新：（1）mRNA结构元素的改良，（2）mRNA制造平台的优化，（3）mRNA传递系统的发展。
3.4.1.mRNA结构元素的改良
鉴于mRNA的基本结构在翻译速率和转录物的半衰期中起着关键作用，结构改进对mRNA疫苗设计感兴趣。翻译的一个关键步骤是5’帽子与真核细胞起始因子4E（eif4e）的结合，这是mRNA翻译的限速步骤。mRNA通过重组牛痘病毒被酶性加帽。去帽酶使mRNA分子失活。也有可用的合成帽子类似物，但这些不太有效。反向加帽是提高mRNA翻译效率和半衰期的技术。最近的研究使用内源性UTRs的整合与进一步去新设计，合理设计mRNA的UTRs以增加蛋白质生产。通过内源性基因表达的生物信息学分析和UTRs的新设计，最有效的5’和3′ UTR组合被检测为NCA-7d作为5′ UTR和S27a加上一个功能基序R3U作为3′ UTR（称为NASAR UTR）。TT3配制的编码受体结合域（RBD）的NASAR mRNA注射在小鼠中呈现有效的疫苗接种，肌肉注射比皮下注射在诱导抗原特异性抗体方面更强大五倍。
此外，当使用一种基于来自阿尔法病毒自放大型RNA的转录RNA分裂载体系统的新型RNA疫苗方法时，可以见证强大的疫苗抗原表达和免疫反应。然后，来自阿尔法病毒自放大型RNA的复制酶可以被删除以形成转录子，转录子具有SAM的无剂量特性，即使作为未配制的mRNA传递，非常低的剂量（50 ng）也可以有效地在小鼠中诱导保护性免疫反应。由于聚（A）尾部是有效翻译和mRNA分子寿命的重要决定因素，因此有必要确保聚（A）尾部的最佳长度，并且在大约100 nt处结合聚（A）尾部对于mRNA治疗生产是理想的。方便和稳定的聚腺苷酸化方法对于mRNA治疗应用至关重要。一项研究描述了一种简单的方法，该方法应用类型IIS限制酶来生成和维护IVT mRNA所需的聚（A）编码DNA序列。简单的方法涉及使用类型IIS限制酶进行重复的不对称切割，然后连接和传播，以将同源序列扩展到环状质粒中的大约100 bp，这可以作为mRNA转录的模板。此外，体外转录的转录物的聚（A）尾部在体内也起作用。
图5 mRNA疫苗的生产过程及mRNA结构和核苷酸修饰。
(A) 目标抗原的鉴定和设计。(2) 数字序列设计。(3) 质粒、mRNA和LNP的制造。(4) 质量控制(QC)。(B) mRNA分子被合成为带有5’帽子的单一结构，并使用化学修饰的核苷酸作为天然核苷酸的替代品。
3.4.2 mRNA制造平台的优化
为了生产治疗级质量的mRNA，需要实施一系列生产流程。尽管目前生产具有特定质量属性的mRNA并不特别具有挑战性，但仍然缺乏一个完善的制造平台。mRNA生产步骤可以分为上游处理，包括酶促生成mRNA，和下游处理，涉及mRNA产品纯化。在上游处理中，用于生成mRNA的IVT酶促反应比传统过程耗时更少，并且在IVT反应中执行的加帽方法显示出高效率。然而，帽子类似物影响生产成本，高昂的价格阻碍了这种方法的普及，特别是在大规模生产期间。或者，一种称为CleanCap的共同转录加帽策略，它不与三磷酸鸟苷竞争，可以在IVT反应期间将天然5’帽子1结构添加到特定的转录起始序列中，从而简化并降低mRNA生产的成本。在下游处理中，去除杂质在mRNA性能中起着至关重要的作用。传统的实验室规模纯化方法包括DNase消化和氯化锂（LiCl）沉淀，这不能去除异常mRNA物种，如dsRNA和截断的RNA片段。
色谱纯化过程在制药生产中很受欢迎。例如，尺寸排除色谱（SEC）根据分子的大小进行分离，但相似大小的杂质，如dsRNA可能被遗漏。离子对反相色谱（IPC）方法可以有效地去除dsRNA杂质，而不影响过程的产量。然而，IPC在规模化时复杂且昂贵，并且使用有毒试剂阻碍了其普及。与IPC相比，离子交换色谱（IEC）显示出更高的结合能力，其可扩展性和成本效益特性使其更适合大规模生产。然而，IEC需要一个更复杂的流程。
一种新的基于纤维素的色谱过程，在实验室和工业规模上都很有用，它基于在乙醇存在下dsRNA对纤维素的选择性结合。这项研究声称，可以从未转录mRNA样品中去除超过90%的dsRNA污染物，无论长度、编码序列或核苷组成如何。mRNA沉淀和切向流过滤（TFF）技术的组合作为一般实验室规模mRNA纯化方法的大规模适应。作者宣称这种方法可以有效地去除反应物、酶和副产品，包括过早中止的RNA序列，同时保持mRNA的完整性。此外，仅使用水性缓冲液作为溶剂，而不是任何腐蚀性或易燃溶剂，这种方法能够成功进行，表明其在纯化mRNA方面的有效性、可靠性和安全性。
3.4.3 mRNA传递系统的开发
mRNA需要穿过细胞膜进入细胞质，以表达特定抗原以维持功能。由于mRNA分子和细胞膜的负电荷、mRNA分子的相对大小以及存在于皮肤和血液中的核糖核酸酶的降解性，这很具挑战性。为了克服这一点，已经探索并使用了多种mRNA传递方法和mRNA传递载体，包括裸露的mRNA传递策略和与传递载体的结合，如基于脂质的材料、聚合物或肽。
裸露的mRNA的传统和自放大型形式，注射包括肌肉/皮下/皮内/静脉/鼻内/模块/肿瘤内注射，可以激发免疫疗法反应，有效地刺激抗原呈递并启动免疫反应。此外，一项研究表明，小鼠皮下注射裸露的mRNA比mRNA纳米颗粒载体引发更强的免疫反应，而mRNA纳米颗粒载体在鼻内和静脉内给药时表现更好。肿瘤内注射肿瘤相关抗原mRNA被认为是一种有前途的疫苗方法，因为它诱导了适当的免疫反应。此外，常见的物理方法如电穿孔、基因枪和微针部分帮助改善mRNA抗原呈递。然而，裸露的mRNA传递系统或物理传递mRNA的方法都不能应用于人类患者，因为它们原始且危险，可能会影响细胞活动，甚至导致异常细胞死亡。
脂质体复合物或脂质体纳米颗粒（LNPs）是最有前途的mRNA传递工具之一，因为它们可以运输疏水或亲水分子（例如，小分子、蛋白质和核酸）。包裹mRNA的阳离子脂质体是最早的脂质体传递材料，它防止mRNA被RNase降解。作为mRNA传递载体开发的pH响应性阳离子脂质旨在提高传递效率，因为其他带负电荷的分子也会与带正电荷的阳离子脂质相互作用，这可能会被免疫细胞捕获。最初探索用于siRNA传递的LNPs，目前是mRNA疫苗最先进的传递系统。LNPs的基本结构包括一个由阳离子脂质、辅助脂质、胆固醇和聚乙二醇组成的脂质双层壳包围的水核心，这稳定了颗粒。LNP介导的mRNA疫苗传递可以诱导持久的、保护性的免疫反应，对抗多种感染病原体，如寨卡病毒和流感，并且在抗击癌症方面也发现了令人鼓舞的结果。
图6 mRNA疫苗在许多疾病的治疗中具有巨大潜力。
1. 代谢疾病：糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、坏血病。2. 肿瘤：黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、肝细胞癌。3. 遗传疾病：唐氏综合症、白化病。4. 过敏性疾病：过敏性哮喘、过敏性紫癜。5. 血管疾病：动脉硬化、心血管疾病、脑血管疾病。6. 传染病：寨卡病毒、HIV、Covid-2019、埃博拉病毒。
有几种基于聚合物的载体，如聚(赖氨酸)(PLL)、聚(酰胺胺)(PAA)、聚(β-氨基酯)(PBAEs)和聚(乙撑亚胺)(PEI)，然而，只有PEI被广泛用于mRNA疫苗传递。尽管PEI提供了高基因转染效率，但其严重的细胞毒性限制了其应用，因此通常通过脂肪酸链进行修饰。一种名为电荷改变可释放转运体(CARTs)的新型含脂聚合物已被探索用于有效传递mRNA分子。mRNA分子和合成的Toll样受体-9激动剂CpG可以通过CARTs封装到纳米颗粒复合物中，然后抗原编码的mRNA可以安全地传递到抗原呈递细胞(APCs)。传递后，mRNA被有效地翻译、处理并由MHCs呈现。同时，CARTs的mRNA和TLR的共传递可以同时转染和激活目标细胞，以激发可以清除小鼠体内已建立肿瘤的免疫反应。一项研究还发现，混合脂质CARTs在转染淋巴细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞方面比单一脂质CARTs更有效。此外，聚合物也可以用来构建mRNA疫苗接种的支架。研究已经证明，基于支架的mRNA传递可以刺激小鼠体内抗原特异性抗体。
尽管探索较少，基于肽的传递方法也可以使用。mRNA与鱼精蛋白紧密结合，不仅为mRNA提供了强有力的保护，防止被核糖核酸酶降解，还诱导了各种免疫细胞如树突状细胞、单核细胞和B细胞的强烈免疫反应。鱼精蛋白配方的mRNA传递系统的临床试验已经证明了其在多种疾病中的治疗效益，如狂犬病和非小细胞肺癌。细胞穿透肽(CPPs)作为新的传递方法，通过促进体内T细胞的免疫反应，调节先天免疫反应，并通过促进mRNA从内体释放，从而允许mRNA在树突状细胞细胞质中表达，加强了树突状细胞和人类癌细胞中的蛋白表达。阴离子肽可以通过激活内体和细胞质模式识别受体(PRRs)，在体外诱导原代人类树突状细胞中适应性反应标志物，而不引起细胞毒性，增加树突状细胞的细胞摄取，以Th1为主。另一项研究开发了一种利用铁蛋白纳米颗粒疫苗传递PreS1到特定骨髓细胞的方法，该方法在小鼠体内诱导了持久的抗-PreS1反应并根除了乙型肝炎病毒。
病毒样颗粒(VLPs)使用病毒作为载体来表达或呈现抗原，包括痘病毒、腺病毒和疱疹病毒，然而，由于安全原因，仅采用复制缺陷病毒或减毒病毒。复制缺陷病毒通过封装抗原编码的saRNA进行病毒感染，将其传递到细胞质中，而减毒病毒保持了自我复制的能力。与前述传递系统相比，VLPs由于安全性和简单的制备方法，已成功应用于促进癌症免疫疗法。VLPs可以通过皮内接种传递，防止疫苗颗粒泄漏到非淋巴器官，如肝脏。此外，VLPs减少了与检查点抗体的联合疗法的负担。一项研究设计了一种使用磷脂双层封装的蛋白-核苷酸核心的mRNA病毒模拟疫苗平台，该核心由编码抗原的mRNA分子、未甲基化的CpG寡核苷酸和带正电荷的蛋白质组成，为治疗性mRNA疫苗提供了一个强大的平台，已在体内外得到证实。
其他传递系统包括细胞外颗粒和微针。细胞外颗粒可以作为有效的传递平台，基于其物理化学特性、高生物利用度和低非靶向细胞毒性。外泌体在癌症疫苗开发中最常用，它通过释放树突状细胞释放的主要组织相容性复合物(MHC) I类/肽复合物，有效地启动CD8+ T细胞以抑制肿瘤生长。微针，包括固体微针贴片和用于皮内注射的空心微针，不仅简化了疫苗分发并提高了患者依从性，还刺激了皮肤的免疫反应。此外，涂有VLPs的微针可以在小鼠体内引发更强的免疫反应，并与肌肉注射相比实现剂量节约。
图7 mRNA疫苗在肿瘤免疫中的作用
4.mRNA癌症疫苗的限制
mRNA癌症疫苗虽然具有多种优势，但仍处于初期阶段。普遍的副作用、生物安全性以及mRNA疫苗的限制需要特别考虑。
4.1.mRNA疫苗的普遍副作用
在COVID-19大流行中广泛观察到mRNA疫苗的副作用。截至本综述，尚未发现COVID-19 mRNA疫苗有严重的副作用。
4.2.mRNA疫苗的生物安全性
4.2.1.生理处置的生物安全性
为了启动适应性免疫反应，先天免疫应适当激活，同时避免有毒的过度激活，这会抑制抗原蛋白的表达以及免疫反应。先天免疫反应通常通过模式识别受体(PRRs)从病原体相关分子模式(PAMPs)激活，检测外源模式。然而，由于与抑制抗原表达的关联，RNA的先天免疫感应可能会减弱免疫反应。具体来说，噬菌体RNA聚合酶产生的dsRNA是不希望的，它可能通过PKR激活先天免疫，导致eIF-2的磷酸化，这可以阻止mRNA翻译。此外，dsRNA在与OAS结合时激活RNase L，导致外源RNAs的降解。而且，与MDA-5和TLR-3结合的dsRNA可以激活I型干扰素。因此，引发其他几个基因并抑制mRNA的翻译。然而，当mRNA结构设计不当时，PRRs也可能被激活，从而取消抗原表达。
4.2.2.不同人群中的生物安全性
为了加快疫苗开发，试验中招募的人口可能比预期有限。当疫苗为全世界的人们设计时，这成为一个问题，因为在更大的人群中可能会出现未知的副作用。某些群体有特定条件。在老年人中，不同的疫苗配方或加强剂量应该提高免疫力反应。在儿童中，由于他们通常比成人表现出更强的反应原性，可能需要低剂量的疫苗，特别是基于mRNA的疫苗。在孕妇中，关于mRNA疫苗的数据有限，这使得难以预期是否发生等效的免疫反应。此外，一些证据表明，遭受持久不良后果的婴儿可能与其母亲中变异的CD4+ T细胞反应有关。在免疫抑制治疗的患者中，疫苗的免疫反应减弱，这值得特别考虑。
4.3.mRNA疫苗的其他限制
4.3.1.类型上的限制
尽管某些细菌和寄生虫可能导致癌症，但针对细菌和寄生虫的mRNA疫苗研究很少。在细菌和寄生虫的繁殖周期中很难找到可以制成疫苗的抗原。此外，一些细菌和寄生虫具有逃避免疫的能力，同时，有效但便宜的抗菌和抗寄生虫药物已经存在。因此，当按成本/效益比评估时，疫苗打算失败。
4.3.2.有效性上的限制
疫苗计划的有效性取决于令人信服的有效性和安全数据以及公众的普遍接受和接种。疫苗的免疫原性和有效性取决于包装、储存、准备和给药等因素。执行供应链不当的风险对疫苗的安全性和有效性有害，可能导致不良事件的潜在后果。此外，疫苗犹豫症仍然是一个值得注意的挑战，被描述为对疫苗接种的“缺乏信心和/或自满”，这可能导致推迟或未能接种疫苗。还有担忧政治压力可能会加速开发和批准过程，导致向公众发布无效的疫苗。
综上所述，mRNA癌症疫苗的安全性与其能够同时编码多种抗原以及是非整合性、高度可降解且没有插入突变潜力有关。为了开发安全有效的mRNA疫苗，必须谨慎进行临床前试验以避免严重的不良事件。即使在批准之后，也需要长期安全性和有效性数据。此外，国际组织之间的合作为mRNA疫苗提供了坚实的资金保障。
4.4.mRNA癌症疫苗的未来
基于mRNA的癌症疫苗是一颗冉冉升起的新星，具有多样化、强大、可扩展、精准、经济且无需冷链的潜力。这些疫苗可以避免与DNA疫苗相关的几个问题，并且可以轻松地大规模生产，用于临床应用。大量针对癌症疗法的临床试验已经显示出公司对推出基于mRNA的癌症疫苗到市场的兴趣，这需要一个可持续且具有成本效益的制造过程，该过程从解决mRNA不稳定、固有免疫原性和体内传递效率低下这三个主要问题中受益。正如我们上面讨论的，适当的mRNA结构修饰技术，如核苷酸修饰和密码子优化，以及新的纯化方法，可能促进mRNA被APCs内化的有效性。此外，mRNA的固有免疫原性可以作为佐剂样效果来增强免疫反应，然而，内在免疫通过干扰素相关途径的矛盾品质可能会引发mRNA降解，导致较少的抗原表达。至于提高传递效率，创新的配方方法，如LNPs、CARTs和CPPs展示了巨大潜力。因此，为了激活适当的免疫反应而不引起有毒的过度激活，优化mRNA序列、mRNA产品的纯度、传递系统和给药途径是重要的。
mRNA基础癌症疫苗的抗肿瘤免疫引发抗体、B细胞介导的体液反应和CD4+/CD8+ T细胞反应。目前作为癌症疫苗开发的主要三种RNA包括：非复制未修饰的SAMs、修饰的SAMs和病毒衍生的SAMs，其中，由于持久效果和节省剂量，SAMs在癌症和传染病中都被广泛研究。SAMs来自正单链mRNA病毒，它们可以自我放大长达2个月，产生更强大和持久的免疫反应，同时，在持久期间，SAMs平台以更低的疫苗剂量要求诱导大量抗原产生。尽管SAMs已经受到广泛关注，并成为基于mRNA疫苗的鼓舞人心的替代品，但癌症治疗的临床应用仅限于病毒复制颗粒的早期评估。随着新抗原的发现，个性化疫苗结合检查点阻断调节剂或细胞因子鸡尾酒已经普及，以增强宿主抗肿瘤免疫并促进肿瘤细胞根除的可能性。个性化的新抗原基础癌症疫苗作为肿瘤特异性治疗，与肿瘤相关抗原相比，新抗原特异性T细胞可能在免疫自我耐受的进展中存活，这增强了强大的T细胞反应，并加强了反应的广度和多样性。此外，这些疫苗针对多种变异突变，以避免脱靶效应，提高了安全性。Moderna公司发明了一种基于mRNA的个性化癌症疫苗，由患者独特的肿瘤新抗原组成。一种针对这些突变的mRNA疫苗，预测了患者癌细胞的20种新表位，被注入患者体内。疫苗能够组织患者细胞表达特定的新表位，并帮助免疫系统区分癌细胞和正常细胞。结果，患者的免疫系统可以更好地区分癌细胞并将其消灭。此外，将基于mRNA的癌症疫苗与其他疗法结合可以增强抗肿瘤效果。2016年，Moderna公司和Merck公司打算将与检查点抑制疗法相关的mRNA-4157与抗PD-1疗法，KEYTRUDA结合。目前，已经进行了一项I期研究，调查mRNA-4157单独在切除实体瘤的受试者中的安全性、耐受性和免疫原性，以及与KEYNOTE-603在不可切除实体瘤受试者中的组合策略。BioNTech进行的两项II期研究评估了基于mRNA的癌症疫苗在治疗抗PD-1耐药/复发的不可切除III期或IV期黑色素瘤患者和接受手术和化疗的结直肠癌患者的有效性、耐受性和安全性。BNT111与Libtayo结合预计能激活针对癌症的强大且精准的免疫反应，而BNT122被认为是结直肠癌患者的精准医疗，根据个人肿瘤特征量身定制，从而成本更高。
疫苗配方的不稳定性阻碍了疫苗在偏远、农村地区的分发，这与温度依赖性降解最相关，高温加速了许多不稳定化途径，导致数百万死于疫苗可预防疾病的人。为此，已经为疫苗的生产、运输、储存和分发开发了冷链系统。冻干，冻干，是长期保存疫苗最常见的方法之一。冻干提供干燥，不损害抗原，也允许无菌过程满足无菌要求。然而，冻干需要重新配制，通常在几小时内用于肠外给药，导致更困难的管理。此外，重新配制可以增加水介导的不稳定化途径，导致冻干疫苗的效力降低。喷雾干燥是生产干燥疫苗的替代方法，因为与传统冻干相比，其成本低且能耗低。然而，应该开发新技术来稳定疫苗，同时减轻传统冻干和喷雾干燥的一些限制。
综上所述，尽管mRNA癌症疫苗显示出巨大的抗肿瘤潜力，但仍有许多问题需要解决以提高疗效，例如免疫原性平台、抗原、佐剂、剂量、传递材料、初次/加强策略、给药频率和途径（见图6）。此外，很少有研究直接比较了不同疫苗的疗效，这应该是未来研究的关键领域。
5.结论和展望
总之，COVID-19大流行促使mRNA疫苗在癌症和传染病领域取得了显著发展。与用于传染病的预防性疫苗相比，大多数癌症疫苗是治疗性的。FDA仅批准了两种预防性癌症疫苗，即HBV和HPV疫苗，分别用于预防病毒引起的肝细胞癌和宫颈癌。治疗性癌症疫苗是一种积极的系统免疫疗法，通过激活和扩展针对特定抗原的CD4+和CD8+ T细胞来加强抗肿瘤免疫。随着技术革新，基于mRNA的癌症疫苗相比其他类型的癌症疫苗展现出更高的疗效，因为mRNA可以同时编码多种抗原，或增强抗体、体液免疫反应和细胞适应性免疫反应。此外，mRNA疫苗的配方平台和生产过程相对成熟，这允许快速且大量地创造或生产癌症疫苗。此外，新抗原的引入促进了个性化的基于mRNA的癌症疫苗应用，提供了更精确和强大的抗肿瘤效果。使用mRNA癌症疫苗的目标应该是在最小化不良反应的同时最大化疗效。尽管mRNA疫苗有许多优点，但进一步改进生产流程，以及更全面地了解多种mRNA疫苗类型的机制作用是必要的。使用mRNA癌症疫苗的目标应该是在最小化不良反应的同时最大化疗效。